文献来源：LixiaZhang,WenhuiLian,PengLi,HaoMa,Xiaoxia，Hana,BingZhao,ZhijunChen

关键词：SERScharacterizationCroceinOrangeGAmyloidprotein-inhibitorinteractionMonitoringfibrillationstates

DOI:10./j.bios..

文章摘要：蛋白质纤维聚集与包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的许多神经退行性疾病有关，淀粉样原纤维抑制及其相互作用的研究对神经退行性疾病的诊断和治疗具有重要意义，作者识别并表征了一种名为CroceinOrangeG(COG)的新型抑制剂，通过各种实验方法和分子对接揭示了其抑制原纤维成核和阻碍原纤维形成的作用。特别是表面增强拉曼光谱(SERS)技术，利用AgIMNPs作为SERS衬底进行无标记检测，有助于识别结合位点，阐明相互作用机制和纤颤过程。结合分子对接，基于sers的方法提供了蛋白质-配体相互作用和蛋白质纤颤的结构信息。本研究表明SERS可以成为研究抑制剂与淀粉样蛋白相互作用的一种强有力的新手段，并可能成为淀粉样蛋白研究的常用工具。

实验表明，ThT（硫磺素T）特异性结合胰岛素原纤维的空洞，导致巨大的荧光增强,然而，当COG存在(与胰岛素孵育6h)时，没有明显的荧光增强，如下图所示：

因此我们假设COG对胰岛素纤颤有抑制作用。纤颤过程可分为三个不同的步骤:成核(0-90分钟)，伸长(90-分钟)和平衡(-分钟)。不同剂量的COG(0~80μM)对胰岛素纤维性颤动有不同程度的影响，如下图所示;

ThT对原纤维进行荧光染色后，可以使用共聚焦荧光显微镜(CFM)监测胰岛素淀粉样蛋白的形成。在选定的时间点，有代表性的图像上显示了COG对淀粉样蛋白形成的影响,如图

在无COG的情况下，随着孵育(低pH加热)时间的增加，蛋白纤维逐渐增加并与ThT结合产生强荧光。然而，当不同浓度的COG存在时，纤颤明显减少甚至完全消除。为了验证COG对CFM图像中蛋白质聚集状态的影响，作者使用原子力显微镜(AFM)观察纤维结构。小的低聚物在COG缺席组和呈现组的滞后时间内形成，如图

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随着时间的推移，蛋白质聚集体的形状发生了变化。虽然在COG存在下形成了细长的原纤维，但在COG（50μM）存在下纤维形成的滞后时间似乎延长了。此外，当存在高浓度的COG（例如80μM）时，纤颤在非晶聚集阶段停止。

胰岛素、COG和COG-胰岛素复合物的SERS光谱如下图所示：

胰岛素的典型振动模式为:和cm-1(Tyr)，和cm-1(Phe)，和cm-1(amideIII带)和-cm-1(CH2变形)。-cm-1处的峰群属于Phe、Tyr和Trp的芳香环，酰胺I带则出现在-cm-1处

胰岛素就像附着在AgIMNPs表面的口袋。COG-胰岛素相互作用拉近了COG与AgIMNPs之间的距离，使COG的SERS信号大大增强。胰岛素在cm-1和(cm-1,cm-1)处的拉曼峰可以分别归因于SS键和Phe残基。峰的出现和模式的强度是由蛋白在AgIMNPs表面的方向决定的。胰岛素在cm-1、cm-1和cm-1处的拉曼峰在胰岛素COG复合物形成后消失，可能是由于胰岛素的结构发生了微妙的二次变化.,这影响胰岛素在AgIMNPs表面的吸附。值得注意的是，COG的磺酸振动带位于、和cm-1并在与蛋白质复合时消失，这表明蛋白质结合区域已被改变。根据SERS光谱分析，这些磺酸基团可能与胰岛素的Phe(cm-1,cm-1)、Tyr(cm-1)和Arg(cm-1)残基结合。cm-1消失的带与COO对应，表明COG接近胰岛素的C端。

AgIMNPs的吸收最大值位于nm(图A)。根据银聚集体的表面等离子体共振(SPR)，作者选择nm作为电磁增强的激发波长。天然胰岛素的加入导致了原始吸收峰强度的损失以及与聚集物尺寸增加相对应的红移。通过TEM测量，AgNPs的尺寸约为60nm(图Ba)。值得注意的是，天然胰岛素诱导AgIMNPs形成聚集物(图Bb)。随着胰岛素纤维性颤动的程度，蛋白包裹的纳米颗粒增大(图Bc)。纤维蛋白似乎带更多正电荷，可以很容易地包裹在带负电荷的银纳米颗粒周围。当纤颤孵育时间达到min时，纳米颗粒的电晕接近15nm(图3d)。这个过程可以用示意图(图C)来说明

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COG对胰岛素的抑制主要发生在纤颤的早期，即成核期(0-90min)，而在延伸和平衡期，COG对胰岛素的纤颤没有影响。这些观察结果与SERS特征一致，COG的SERS在胰岛素颤动过程中表现出相应的变化(图D)。相反，在没有COG的情况下，纤维性颤动过程中蛋白质的SERS信号几乎没有差异。这一意外发现提出了COG可能用于监测蛋白质纤维性颤动的可能性。因此，COG在某种程度上是一种独特的探针样分子，用于纤维性颤动的SERS监测，而其他测试的淀粉样蛋白抑制剂则不是。

文章总结：COG是一种有效的早期淀粉样蛋白纤维性颤动的抑制剂。作者证明SERS可以深入了解小分子和生物大分子之间的相互作用。这是首次将SERS应用于研究抑制剂与淀粉样蛋白的相互作用。结合分子对接，以AgIMNPs为底物的sers平台可以快速获取蛋白质-配体相互作用和蛋白质纤颤的结构信息。作者希望这种方法对研究淀粉样蛋白和抑制剂之间的相互作用具有广泛的意义。